微生物的測(cè)定——顯微鏡法
2021-09-16 13:22:32
天緯化學(xué)小編
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如何測(cè)定微生物的數(shù)量對(duì)于微生物研究至關(guān)重要,目前最常用的方法包括顯微鏡法、平板計(jì)數(shù)法、分光光度法、流式細(xì)胞法等,各有優(yōu)缺點(diǎn),本文首先介紹顯微鏡法。細(xì)胞數(shù)量可以通過(guò)簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)定。顯微鏡計(jì)數(shù)可以對(duì)玻片上干燥的樣品或液體樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。干燥的樣品可以染色,以增加細(xì)胞與其背景之間的對(duì)比。對(duì)于液體樣品,計(jì)數(shù)室由刻蝕在載玻片表面的已知面積的正方形網(wǎng)格組成。在顯微鏡下,單位面積網(wǎng)格上的細(xì)胞數(shù)量可以數(shù)出來(lái),每毫升懸浮液的細(xì)胞數(shù)就能簡(jiǎn)單計(jì)算出來(lái)(如下圖所示)。顯微計(jì)數(shù)是一種快速簡(jiǎn)便的微生物細(xì)胞數(shù)量估算方法,但存在以下問題:如果沒有特殊的染色技術(shù),就無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性一般;小小的細(xì)胞往往很難看的清楚,這可能導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn);如果細(xì)胞懸浮液的密度低(少于106個(gè)細(xì)胞/毫升),視野中將幾乎沒有細(xì)胞;對(duì)于運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞,觀察前需要將其殺死(通常用甲醛)或固定;樣品中的雜質(zhì)會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色是常見的研究手段。例如,DAPI(4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)能夠染色所有細(xì)胞,因?yàn)樗軌虼┩讣?xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生比自身強(qiáng)20多倍的熒光,DAPI染劑利用紫外光激發(fā),與DNA結(jié)合時(shí)最大吸收波長(zhǎng)為358 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)461 nm;熒光染料PI(碘化丙啶)是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑,但染料不能透過(guò)細(xì)胞膜,常用于死細(xì)胞的檢測(cè)。因此,DAPI/PI染色經(jīng)常組合使用,用于檢測(cè)細(xì)胞的生存狀態(tài)。通過(guò)將熒光染料附著在特定的核酸探針上,可以制備出對(duì)某些生物(群)具有高度特異性的熒光染色劑,這方面用的很多的是熒光原位雜交(FISH)?;诖呋囟ùx過(guò)程的功能基因的熒光探針也已開發(fā)出來(lái),如果細(xì)胞被這些探針染色,就可以推斷它們具有行使該代謝的能力,對(duì)研究微生物生態(tài)很有幫助。
參考資料:
Brock Biology of Microorganisms, 15th Edition
5.6 Microscopic Counts of Microbial Cell numbers
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